Кошкин дом. Всё о котах и кошках

ПОЛУЧЕHИЕ РАHHИХ ЗАРОДЫШЕЙ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С HИМИ

Суперовуляция. Гормональную обработку кошек экзогенными гормонами используют для получения индуцированного эструса, развития фолликулов и овуляции во время анэструса. Методики, используемые для получения эстрального поведения, включают обработку ФСГ гормоном с последующим спариванием или с обработкой человеческим хориогонином для получения индуцированной овуляции, если самок осеменяют искусственно. Для искусственного осеменения самок используют свежеполучеииую или замороженную сперму. Сперму получают при электростимуляции или на искусственную вагину. Сразу же после сбора эякулят помещают в стерильпый 0.9%-й раствор NaCl, доводя общий объем до 500 мкл. В том случае, если после сбора сперму замораживают, то в раствор добавляют криопротектор. Если же для осеменения используется свежая сперма - определяют подвижность сперматозоидов и их морфологию. Подвижность сперматозоидов должна быть не менее 80-85%, Забор спермы проводится при анестезин кетамин-хлоридом (33.0 мг/кг живого веса). Осеменение кошек проводят на 2-й или 3-й день эструса. Овуляция у самок индуцируется спариванием с вазэктомированным самцом или инъекцией 250- 500 м. е. HCG на 1-й или 2-й день эструса. При осеменении кошки также слегка анестезируются кетамином (6 мг/кг живого веса). Кошка фиксируется и раствор NaCl с содержащимися в нем сперматозоидами вводится пипеткой в матку. Для эффективного осеменения необходимо вводить 50-100 млн сперматозоидов с нормальной подвижностью.

Выход потомков при использовании замороженной и свежей спермы одинаков, но несколько ниже, чем при естественном оплодотворении (1-3 и 3-6 котят на самку соответственно).

Развитие работ по экспериментальной эмбриологии кошек вызвало необходимость разработки методов для получения суперовуляций. Правильно подобранные дозы и сочетания гормонов дают возможность получить большое количество яйцеклеток. Анализ 8 различных режимов п дозировок обработки анэстральиых кошек позволил Дрессеру с соавторами рекомендовать метод, включающий последовательную обработку фолликулостимулирующим гормоном гипофиза (ФСГ-II) в дозе 0.75 мг на самку в течение первых 5 дней и в дозе 0,25 мг на 6-й день и введение двух доз по 375 м. е. человеческого хориогонина на 6- и 7-й день. Такая обработка приводит к овуляции 30.9 +/- 9,5 яйцеклетки, тогда как в норме овулирует около 5. Использование сыворотки жеребой кобылы (СЖК) также приводит к суперовуляции (образуется около 60 желтых тел). Однако обработка экзогенными гормонами кроме увеличения количества овулировавших яйцеклеток вызывает и формирование многочисленных ановуляторных фолликулов и снижение количества нормально развивающихся зародышей. Эти отрицательные эффекты связывают с незрелостью, атрезией или хромосомными аномалиями ооцитов, снижением оплодотворяемости в ответ на гиперстимуляцию.

Оплодотворение in vitro. Для наблюдения за ранними стадиями развития зародышей кошек может быть использовано оплодотворение яйцеклеток in vitro. Для этой цели используют яйцеклетки, полученные после гормональной стимуляции самок. Для манипуляций и культивирования ооцитов in vitro чаще всего используют модифицированный Кребс-Рингеровский раствор. Яйцеклетки, освобожденные от клеток кумулюса, помещают в капли под парафиновое масло и инкубируют в атмосфере, содержащей 5% СO2 при 37 С с добавлением сперматозоидов. Для оплодотворения in vitro может быть использована сперма, полученная от самцов методом электростимуляции или на искусственную вагину и прошедшая капацитацию в половых путях, сперма, полученная из семявыносящих канальцев или придатка семенника. Следует отметить, что успешное оплодотворение оказывается возможным только в том случае, если сперматозоиды предварительно прошли капацитацию или в половых путях самки. или в культуральной среде.

Трансплантация эмбрионов. Первые попытки трансплантации эмбрионов у кошки были предприняты в 1977 г. В качестве доноров использовались самки со спонтанным эструсом. Реципиенты спаривались с вазэктомированными самцами или овуляция вызывалась у них гормональной обработкой. В обоих случаях было продемонстрировано нормальное протекание беременности, завершившееся рождением нормальных котят.

Сравнение результатов, полученных при пересадке зародышей при естественном эструсе и гормональном стимулировании, показало. что для пересадок можно использовать и эмбрионы, полученные при суперовуляции. Кошки получали по 20 мг FSH (FSH-Р) в течение 5 дней - режим, эффективный для индукции эструса у анэстричных самок. Hачиная с первого дня эструса самкидоноры спаривались с интактными самцами по 3 раза в день с 3-4-часовым интервалом между спариваниями в течение 3 дней (1-3-й день эструса) . В экспериментах по пересадке эмбрионов кошки необходимо добиваться строгой синхронизации сроков беременности между донором и реципиентом. Поэтому самокреципиептов или отбирают по проявлению эстрального поведения или используют ту же гормональную обработку, что и для доноров, но спаривают с вазэктомированным самцом. Для подтверждения овуляции самки обследуютея лапароскопически на 4-й или 5-й день эструса.

Сбор эмбрионов проводят на 7-й или 8-й день после фиксированного спаривания. К этому сроку зародыши достигают стадии поздней морулы или ранней бластулы. Для анестезии используют кетамин-хлорид-acepromazino maleato (10:1. 20,0 мг/кг и 2,0 мг/кг). Лапаротомия проводится по белой линии живота, на 2-3 см от бифокацип матки. Рога матки промываются через катетер 25-30 мл теплой (37 C) среды Hamюs-FIO, сосодержащей 5% инактивированной эмбриональной сыворотки. Капли промывной жидкости просматриваются под стереомикроскопом, эмбрионы с помощью пипетки переносятся в свежую порцию среды и оцениваются по морфологии. Пересадка эмбрионов у кошки проводится хирургическим методом, поэтому самки-реципиенты также подвергаются операции лапаротомии. Пересадка зародышей осуществляется в один или оба рога матки. В стенке матки (ближе к яичниковому концу) делается прокол, через который вводится пипетка, в которой в капле среды нахолятся эмбрионы. Беременность определяется па З5-й день пальпацией живота самки пли после рождения котят.

Возможна успешная пересадка эморионов, полученных после индуцированного гормонами эструса, пункции фолликулов, культивирования и осеменения in vitro в Кребс- Рингеровском растворе с добавлением 20% эмбриональной сыворотки фолликулярных ооцитов. В результате такой пересадки было получено 5 пометов (4 из 18 подсаженных зародышей: 1 из 13; 3 из 8; 1 из 8 и 1 из 7). Hо следует помнить, что использование суперовуляцпп часто ведет к образованию большого количества дефектных ооцитов и, как следствие, к высокому уровню нарушений в развитии эмбрионов.

Была также показана возможность успешной трансплантации эмбрионов после их криоконсервации. После размораживания они культивировались в среде Эрла. или FIO с добавлением 20% эмбриональной сыворотки, а затем были трансплантированы в матку синхронизированных реципиентов. Приживаемость эмбрионов составила 12.4%. К сожалению, у кошек возможна лишь хирургическая пересадка зародышей, поэтому оперированные самки могут быть использованы лишь один раз.